Die russische Kirche auf der Mathildenhöhe wurde vom letzten russischen Zaren Nikolaus II. und der Zarin Alexandra (Prinzessin Alix von Hessen-Darmstadt) aus Privatmitteln erbaut. Das tief religiöse Herrscherpaar wollte bei seinen Familienbesuchen in Darmstadt nicht auf russisch-orthodoxe Gottesdienste verzichten. Aus diesem Grunde spendete der Zar die Mittel zum Bau der Kirche auf der Mathildenhöhe, die daher Privateigentum der Zarenfamilie war.
Die Kirche wurde als erstes Gebäude auf der Mathildenhöhe errichtet. Erst später entstand das von Ernst Ludwig geförderte Jugendstilensemle. Die Kirche ist im Stil der frühen Jaroslawer Kirchen erbaut. Sie steht auf Erde, die eigens aus Russland nach Darmstadt transportiert worden war und aus allen Gouvernements stammte. Mit ihren vergoldeten Zwiebelkuppeln und reich ornamentierten vergoldeten Dachfirsten stellt diese Kirche ein Kleinod russischer Kirchenbaukunst in Deutschland dar.
Auch der zum Bau verwandte Marmor im Sockelbereich stammte „“aus Russland““, d.h. aus dem Kaukasus. Die Baupläne entwarf der Rektor der Petersburger Akademie der Künste, Prof. Benois, der auch die Kirche in Bad Homburg erbaute. Die Kacheln an der Außenfassade und in den Türmen der Zwiebelkuppeln wurden von der Firma Villeroy und Boch speziell für die Kirche angefertigt. Auf den Kacheln wie auch den geschmiedeten Dachfirsten sind stilisierte Zarenadler angebracht. Die Ikonen der Ikonostase wurden von dem bekannten russischen Kirchenmaler Karl Timoleon Neff gemalt.
Für die russische Emigration ist die Kirche in Darmstadt Gedenk- und Pilgerstätte zugleich: zum Jahrestag der Ermordung der Zarenfamilie (4./17.Juli) wurden früher in der Kirche jährlich eine Panichida (Totenamt) zelebriert, seit der Verherrlichung der Neo-Märtyrer und Bekenner Russlands im Jahre 1981 wird in der Kirche am Todestag der Zarenfamilie eine bischöfliche Liturgie mit einem Moleben (Bittgottesdienst) an die kaiserlichen Neo-Märtyrer „“Märtyrer Zar Nikolaus, Märtyrer Zarin Alexandra, Märtyrer Zarewitsch Aleksij und die Märtyrer-Zarentöchter Olga, Tatjana, Maria und Anastasija““ zelebriert. Im Anschluss an diese Feier findet eine Prozession mit der Ikone der Zarenfamilie um die Kirche statt.
Die Grundsteinlegung der Kirche erfolgte am. 16. Oktober 1897 (Gedenktag des Hl. Märtyrers Longinos, d. Hauptmanns, der am Kreuze des Herrn stand) in Anwesenheit des russischen Kaiserpaares. Im Darmstädter Tagblatt v. 18.10.1897 wurde die Zeremonie wie folgt beschrieben: „“Auf dem für den Bau bestimmten Grundstücke war ein prachtvoller, reich hergerichteter Pavillon erbaut worden. Derselbe stellte einen Rund bau mit vier vorspringenden Nischen dar. Die westliche und südliche derselben, die mit reichen, zum Teil echten kostbaren Stoffen drapiert waren, waren für den Eingang bestimmt, in der östlichen befand sich der Grundstein und in der nördlichen waren die Pläne der Kapelle und Proben der für den Bau zur Verwendung gelangenden Steine ausgelegt. Der Pavillon…. war mit einem aus grünem Stoffe hergerichteten Baldachin gekrönt, der von einer, den ganzen Bau überragenden russischen Kaiserkrone zusammengehalten wurde… Nach dem die Allerhöchsten Herrschaften das Innere des Pavillons betreten hatten, begann die feierliche Handlung… Die Feier leitete der aus Petersburg zu diesem Zwecke hier eingetroffene Protopresbyter und Beichtvater Sr. Majestät v. Janyscheff unter Assistenz des aus Wiesbaden dazu berufenen Erzpriesters Protopopoff… Die ganze Handlung machte, trotzdem sie in russischer Sprache vollzogen wurde und im Wesentlichen den der russischen Sprache Unkundigen unverständlich blieb, einen überaus feierlichen Eindruck““. Die Weihe der Kirche erfolgte am 26. Sept. 1899 (am Festtag des Entschlafens des Hl. Apostels Johannes). Auch dieses Mal kamen Zar Nikolaus II. und Zarin Alexandra mit der Familie wieder nach Darmstadt.
Die Ikonostase, das Altartuch und die Kirchenfahnen stammten aus der Londoner Privatkirche der Großfürstin Maria Alexandrowna (Tochter Alexanders II.), der Herzogin von Sachsen-Coburg-Gotha, Außerdem wurden aus der Londoner Kirche der aus Eichenholz geschnitzte Sarkophag mit dem Grab Christi (an der rechten Kirchenwand) der Kirche in Darmstadt geschenkt. Das liturgische Gerät wurde eigens für die Kirche geschaffen. Die Ausschmückung der Kirche mit den Mosaiken (in der Apsis des Kircheninneren und an den Außenwänden) war erst im Jahre 1903 beendet.
Nach Ausbruch des I. Weltkrieges wurde die Kirche geschlossen, alle Edelmetalle, die Glocken, wie auch die ursprünglich sieben angebrachten Dachkreuze, wurden als „“Feindvermögen““ beschlagnahmt. Das ganze Ausmaß dieser Beschlagnahme geht aus der Beschreibung der Gebäude-Versicherungsurkunde vom Jahre 1926 hervor: „“Entfernt wurden die Vergoldung der Turmdächer, sowie die Vergoldung der Kreuzaufsätze, Kupfereindeckung des Daches, sowie Kupferrinne und Kupfereinfassung, 5 Glocken, 4 Fenster mit Glasmalereien in Eisen und Bleieinfassung und die vergoldete schmiedeeiserne Altartür.““ Als Folge der Entfernung der Dacheindeckungen und der Dachrinnen waren schwere Schäden durch eindringendes Wasser entstanden, die nur notdürftig in den 20er Jahren beseitigt wurden. Weitere schwere Schäden erlitt die Kirche durch Bombenangriffe im Jahre 1944. Ein Teil der goldenen und silbernen liturgischen Gefäße, von der Zarenfamilie gespendet, wurde in der Folge gestohlen. Das gerettete Inventar bewahrte man bis zur Renovierung der Kirche im Januar 1946 im. Darmstädter Museum auf.
Die Kriegsschäden waren in den Jahren 1945/1946 nur notdürftig beseitigt worden. So mussten an der Kirche mehrmals in den 50er und 70er Jahren umfangreiche und sehr kostenaufwendige Reparaturen durchgerührt werden, um dem weiteren Verfall Einhalt zu gebieten. Im Frühjahr 1955 wurden die Reparaturarbeiten beendet und die Kirche von Erzbischof Alexander am 24. April/ 7. Mai 1955 neu geweiht. Weitere Reparaturen wurden in den 70er Jahren am Dach und Mauerwerk erforderlich. Allein diese Arbeiten beliefen sich auf fast 300 000 DM. Diese Kosten wurden durch großzügige Spenden der Evangelischen Kirche, der Stadt Darmstadt und des Landes Hessen und durch bedeutende Privatspenden gedeckt. Von der Diözese wurden insgesamt 50 000 DM bereitgestellt. Die Renovierungsarbeiten der 70er Jahre – die Vergoldung der Zwiebelkuppeln und der Dachfirste – konnten im Herbst 1976 abgeschlossen werden. Die Kirche wurde dann am 23. Oktober 1976 durch die Bischöfe Paul (Russische Orthodoxe Kirche) und Lavrentije (Serbische Orthodoxe Kirche) wieder geweiht. Gegenwärtig muss der Glockenturm repariert werden.